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本试剂盒中的2×Multiplex PCR Master Mix是一种即用型的溶液，含有dNTP、MgCl₂、multiplex PCR Buffer和一些PCR添加剂，能提高扩增效率及减少引物二聚体的形成。用户只需要添加模板，引物，HS Taq DNA Polymerase和水，即可配成PCR反应体系。

提供的HS Taq DNA Polymerase为非活性状态，室温下无聚合酶活性。能有效防止体系配制过程和反应初启动升温过程中非特异性产物和引物二聚体的形成，提高反应效率。HS Taq DNA Polymerase在4min,95℃孵育阶段可被激活。此外，热启动允许反应体系在室温下配制，快速且方便。

2×Multiplex PCR Master Mix中MgCl₂终浓度为4mM，适合大多数的多重PCR反应，此外，MgCl₂浓度对于引物退火影响很小，所以通常不需要优化Mg²⁺浓度。

• 模板DNA
  多重PCR实验通常比常规PCR实验需要更高含量的模板。起始反应时每个反应体系至少应含有10ng的基因组DNA，或至少1ng不太复杂的DNA(如质粒或病毒DNA)。
  
• 多重引物设计
  为得到最理想的结果，在一次多重PCR实验中，所有PCR产物的长度均应小于1kb。如果PCR产物的长度>1kb，那么需要提高相应的引物浓度。在进行多重PCR反应之前，需要对每一对引物进行单独扩增，验证引物的特异性及扩增效率，根据每对引物的扩增效率来调整每对引物在多重PCR反应体系中的用量。
  
• 引物浓度
  在一次多重PCR反应中，每种引物终浓度通常为50 nM～200 nM。但是，一些引物对扩增效率低于其它引物，提高引物浓度将有助于其扩增。比如，在一次实验中，一个扩增子的得率低于其它扩增子，提高该扩增子的引物浓度将有助于增加其得率。
  
• 冰上溶解各组分并将所有溶液短暂离心
  
• 根据下列方法配制10×primer mix(每种引物含有2μM)
  

  成分	用量
  引物贮备液浓度	100μM
  每种引物	10μL
  TE Buffer	可调整
  总体积	补足至500μL

• 根据下表配制一份反应体系
  

  成分	用量
  2×Multiplex PCR Master Mix	25μL
  10×primer mix(2μM each)	1.25～5μL (50～200 nM)
  Template DNA	1～500ng
  HS Taq DNA Polymerase(5U/μL)	1μL
  Sterilized ddH2O	至50μL

• 将反应管置于离心机并离心30~60 s。
  
• 如果使用的热循环仪没有热盖功能，用矿物油覆盖反应液。
  
• 将样品放入循环仪中并根据下列循环程序直接开始PCR。
  

  步骤	温度	时间	循环次数
  初始变性	95℃	4min	1
  变性	95℃	30sec	35～40
  退火	Tm-5℃	0.5～1min
  延伸	72℃	1min/kb
  终延伸	72℃	10min	1

• 扩增10个不同区域的人类基因组DNA，10个多重PCR产物长度分别为783,707,641,585,507,438,337,274,224 127bp。
  
• 根据下表准备反应体系
  

  成分	用量
  2×Multiplex PCR Master Mix	12.5μL
  10×primer mix(2μM each)	60/80/100nM
  Human genomic DNA	100ng
  HS Taq DNA Polymerase(5U/μL)	0.5μL
  Sterilized ddH2O	补足至25μL

• 将反应管放入离心机并离心30~60 s。
  
• 将样品放入循环仪中并根据下列循环程序开始PCR。
  

  步骤	温度	时间	循环次数
  初始变性	95℃	4min	1
  变性	95℃	30sec	35
  退火	60℃	30sec
  延伸	72℃	1min
  终延伸	72℃	10min	1

• 10个多重PCR产物通过3%琼脂糖凝胶电泳显示(图1)
  
  图1．10个多重PCR产物的琼脂糖凝胶电泳，M:DNA Marker H1(100～1000bp)